多重免疫組化染色原理 ：利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，使一抗與組織或細(xì)胞中的靶抗原結(jié)合；加入HRP標(biāo)記的二抗，它能與一抗特異性結(jié)合，形成“抗原-一抗-HRP標(biāo)記二抗"的復(fù)合物，加入酪胺熒光染料，在HRP和過氧化氫的存在下，酪胺被活化并與抗原附近的蛋白殘基共價(jià)結(jié)合，大量的熒光素沉積在抗原-抗體結(jié)合部分，使信號(hào)得到放大，通過多次重復(fù)上述步驟，每次使用不同的一抗和對(duì)應(yīng)的酪胺熒光染料，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)

多重免疫組化染色實(shí)驗(yàn)步驟

樣本準(zhǔn)備：包括石蠟切片、冰凍切片或細(xì)胞爬片等的處理，如固定、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶等。

一抗孵育：滴加用抗體稀釋液稀釋好的一抗，在避光濕盒內(nèi)孵育一定時(shí)間。

二抗孵育：洗滌后加入與一抗相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記二抗，避光室溫孵育。

TSA熒光染料染色：滴加酪胺熒光染料，室溫反應(yīng)一段時(shí)間后洗滌。

抗體洗脫：采用熱修復(fù)或抗體洗脫液等方法洗脫前一輪的抗體，以便進(jìn)行下一輪標(biāo)記。

重復(fù)標(biāo)記：重復(fù)上述步驟，使用不同的一抗和熒光染料，實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記。

復(fù)染細(xì)胞核及封片：用DAPI等核染料復(fù)染細(xì)胞核，滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

鏡檢拍照：在熒光顯微鏡等設(shè)備下觀察并采集圖像。

多重免疫組化染色注意事項(xiàng)

抗體選擇與優(yōu)化：要選擇特異性高、經(jīng)過驗(yàn)證的抗體，并優(yōu)化抗體的濃度和孵育時(shí)間等條件。 

表位掩蔽問題：注意抗體的染色順序，避免表位掩蔽現(xiàn)象，可通過調(diào)整抗體順序或采用其他方法來解決。

實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置：設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

信號(hào)放大倍數(shù)的控制：根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求和熒光信號(hào)強(qiáng)度，合理選擇是否添加TSA增強(qiáng)劑等手段來控制信號(hào)放大倍數(shù)。